ELISA實驗：標準品稀釋步驟指南

　　本生(BUNSEN)為您詳細講解ELISA實驗中稀釋標準品的關鍵步驟和注意事項。這是實驗成功與否的基石，精確的稀釋決定了標準曲線的質量，從而直接影響最終結果的準確性。

　　一、核心原則

　　標準品稀釋的目的是創建一系列已知濃度的標準點，用以繪制標準曲線(通常為S型或線性化后的直線)。未知樣本的濃度將通過此曲線計算得出。因此，稀釋的精確性和一致性至關重要。

　　二、實驗前準備

　　試劑與材料：

　　標準品凍干粉:從冰箱中取出，室溫靜置15-20分鐘平衡至室溫。

　　標準品/樣本稀釋液:務必使用試劑盒指定的專用稀釋液。不同的檢測目標(細胞因子、激素等)可能需要不同的基質(如血清、血漿模擬液)，以避免干擾。

　　去離子水或超純水：用于復溶凍干粉。

　　無菌離心管(1.5mL EP管)、試管或細胞培養板(用于系列稀釋)。

　　精確的可調移液器(如P1000, P200, P20)及匹配的、潔凈的低吸附吸頭。

　　渦旋混合器 和 小型離心機。

　　說明書：

　　仔細閱讀試劑盒說明書，確認標準品的初始濃度(如 1000 pg/mL)和需要復溶的體積(如 500 μL)。

　　確認說明書建議的標準曲線濃度范圍(如 7.8 pg/mL - 500 pg/mL)和稀釋倍數。常見的梯度是倍比稀釋(Serial Dilution)。

　　三、操作步驟

　　第一步：復溶

　　離心：將標準品凍干粉管短暫離心(如 3000 rpm, 1分鐘)，使粉末集中到管底，避免開蓋時損失。

　　加液：加入說明書指定體積的去離子水或指定的復溶液。

　　混勻：輕輕渦旋(避免產生過多氣泡)或上下吹打至少1分鐘，確保粉末溶解。切勿劇烈振蕩。

　　靜置：室溫靜置10分鐘，使其充分水化。此時溶液的濃度即為最高濃度儲備液(Stock Solution)。

　　第二步：配制最高濃度點

　　取一個潔凈試管，加入一定體積的稀釋液(例如 900 μL)。

　　吸取一定體積的復溶后的標準品儲備液(例如 100 μL)加入稀釋液中。

　　輕輕渦旋或吹打混勻。此管濃度即為標準曲線的最高濃度點(例如，1000 pg/mL儲備液稀釋10倍，得到 100 pg/mL的最高點)。

　　示例：若儲備液為1000 pg/mL，要配制500 pg/mL的最高點，可采取1:1稀釋(如500μL儲備液 + 500μL稀釋液)。

　　第三步：系列倍比稀釋

　　這是最關鍵的一步。以制備7個濃度點為例(從最高濃度點開始稀釋)：

　　取7-8個排在一起的試管或孔板，除第一管外，每管加入等體積的稀釋液(例如 300 μL)。

　　第1管：加入與稀釋液等體積的“最高濃度點"溶液(例如 300 μL)，此時第1管濃度即為最高濃度(如 100 pg/mL)。

　　第2管：從第1管中吸取等體積液體(例如 300 μL)，移至第2管中。輕輕吹打或渦旋混勻。

　　后續管：重復此過程：從第2管取 300 μL 加入第3管，混勻;從第3管取 300 μL 加入第4管，混勻……直至稀釋到最后一管。

　　最后一管：從最后一管(濃度點)中吸取 300 μL 液體并棄去，以保證所有管的體積一致。

　　四、關鍵注意事項(本生提醒您)

　　低溫操作：對于非常不穩定的蛋白，整個稀釋過程請在冰上進行，并使用預冷的稀釋液和器具。

　　避免吸附：使用低吸附的移液器吸頭和試管，以減少蛋白在管壁上的損失，這對于低濃度點尤其重要。

　　充分混勻：每一次轉移后都必須充分混勻，這是保證梯度準確性的關鍵。但需避免產生氣泡。

　　更換吸頭!每一步稀釋都必須使用新的無菌吸頭，否則會污染后續所有濃度，導致實驗失敗。

　　及時使用：稀釋好的標準品應盡快加入酶標板孔中，通常建議在30分鐘內使用。

　　設置復孔：加樣時，每個濃度點建議做2-3個復孔，以提高數據的可靠性。

　　通過遵循以上步驟，您將能制備出一條準確、可靠的標準曲線，為整個ELISA實驗的成功奠定堅實基礎。

　　注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產品說明請咨詢技術老師或品牌供應商。

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