加入酶標記檢測抗體的核心注意事項

    使用酶標記檢測抗體（常見的是酶標二抗）是ELISA、WesternBlot、免疫組化等實驗中的關鍵步驟。以下是需要重點關注的方面，分為實驗前、實驗中、實驗后三個階段。

    一、實驗前準備：抗體選擇與保存

    特異性是關鍵

    宿主來源：確保檢測抗體（二抗）所針對的宿主物種與一抗的宿主物種匹配。例如，小鼠來源的一抗應選擇抗小鼠的酶標二抗。

    免疫球蛋白類型：確認一抗的亞型（如IgG,IgM），并選擇針對該亞型的二抗，以獲得信號。

    交叉吸附：在進行多重檢測或樣本含有多種物種蛋白時，應選擇經過交叉吸附的二抗，以減少非特異性結合。

    酶與底物系統的選擇

    HRP（辣根過氧化物酶）：

    優點：成本低、靈敏度高、底物多樣（如TMB,DAB）。

    注意事項：嚴禁使用含疊氮鈉（NaN?）的緩沖液，因為NaN?是HRP的抑制劑。同時，要避免溶液被微生物污染。某些還原劑（如DTT）也會使其失活。

    AP（堿性磷酸酶）：

    優點：穩定性好，不受NaN?影響。

    注意事項：應避免使用含有磷酸根離子的緩沖液（如PBS），因為磷酸根是AP的競爭性抑制劑。推薦使用Tris緩沖液。

    抗體的保存與稀釋

    正確保存：嚴格按照說明書要求保存，通常是-20℃分裝凍存，避免反復凍融。

    使用前離心：短暫離心小管，將液體收集至管底，避免損失和起泡。

    優化稀釋比例：必須進行預實驗來優化二抗的稀釋比例。說明書提供的范圍是一個參考起點。濃度過高會導致背景深，濃度過低則信號弱。

    二、實驗過程中：孵育與洗滌

    封閉要充分

    在加入檢測抗體前，必須用惰性蛋白（如BSA、脫脂奶粉、血清等）對膜或板進行充分封閉，以封堵非特異性結合位點，這是降低背景的關鍵。

    孵育條件優化

    溫度與時間：室溫孵育1小時或4℃過夜。4℃過夜通常結合更牢固，背景更低，但需要更長時間。室溫孵育更快捷，但需注意控制時間和溫度，避免背景過高。

    避光：如果酶標抗體偶聯了熒光染料，整個孵育過程需避光。

    均勻孵育：確保抗體溶液能均勻覆蓋整個樣本，放在搖床緩慢搖動孵育效果更佳。

    洗滌至關重要

    洗滌：孵育后，必須使用洗滌緩沖液（如TBST、PBST）進行充分且嚴格的洗滌，以去除未結合的游離抗體。這是降低背景有效的一步。

    洗滌次數與體積：通常建議洗滌3-5次，每次浸泡并搖動3-5分鐘。使用足量的洗滌液。

    三、實驗后：顯色與結果分析

    底物使用與顯色

    新鮮配制：尤其是HRP的底物，建議在使用前新鮮配制，以保證其活性。

    避光反應：某些底物（如ECL）對光敏感，顯色反應需在暗室進行。

    控制反應時間：顯色反應時間不宜過長，否則會導致背景過高。一旦達到理想的信號強度，應及時終止反應（對于ELISA）或進行成像（對于WB）。

    設立對照

    陰性對照：不加一抗（只加封閉液和二抗），用于評估二抗的非特異性結合背景。

    空白對照：不加一抗和二抗，用于評估底物自身的顯色情況。

    陽性對照：使用已知陽性的樣本，確保整個實驗系統工作正常。

    總結

    成功使用酶標記檢測抗體是一個系統性的優化過程，核心在于：

    選對（特異性）

    用好（稀釋度、孵育條件）

    洗凈（降低背景）

    控好（底物反應與對照）

    遵循以上注意事項，將能顯著提高實驗的可靠性、靈敏度和重復性。

    注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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