人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說(shuō)明書

　　BS-9809人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒

　　一、產(chǎn)品概述

　　本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，專用于檢測(cè)人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等樣本中的VEGF-A濃度。僅供科研使用。

　　二、試劑盒組成

　　預(yù)包被微孔板?：12孔×8條(96孔規(guī)格)或12孔×4條(48孔規(guī)格)，預(yù)包被抗VEGF-A捕獲抗體。

　　標(biāo)準(zhǔn)品?：凍干粉，需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶后倍比稀釋(建議濃度梯度：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL)。

　　檢測(cè)抗體-HRP?：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗VEGF-A抗體。

　　洗滌緩沖液?：20×濃縮液，需用蒸餾水按1:20稀釋。

　　底物溶液?：TMB顯色液A/B，使用前1:1混合，15分鐘內(nèi)用完。

　　終止液?：2M溶液。

　　樣本稀釋液?：用于稀釋高濃度樣本。

　　封板膜?：2張，用于溫育時(shí)密封微孔板。

　　三、實(shí)驗(yàn)原理

　　VEGF-A與預(yù)包被捕獲抗體結(jié)合，形成“抗體-抗原"復(fù)合物;加入HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體后，形成“夾心結(jié)構(gòu)"。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，加入TMB底物顯色(藍(lán)色)，終止液終止反應(yīng)后變黃色。450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD值)，濃度與OD值呈正比。

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　樣本準(zhǔn)備?

　　血清/血漿：離心去除顆粒物，避免溶血;2-8℃保存≤48小時(shí)，長(zhǎng)期保存需-20℃/-80℃(避免反復(fù)凍融)。

　　細(xì)胞上清：離心取上清，避免含高濃度蛋白酶劑。

　　試劑準(zhǔn)備?

　　洗滌液：濃縮洗滌液室溫結(jié)晶時(shí)，40℃水浴溶解后按1:20稀釋。

　　標(biāo)準(zhǔn)品：復(fù)溶后倍比稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　底物：TMB A/B液1:1混合，避光保存。

　　操作流程?

　　加樣?：每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，37℃孵育90分鐘。

　　洗滌?：甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液浸泡1分鐘/次，重復(fù)3次。

　　加檢測(cè)抗體?：每孔加入100μL HRP標(biāo)記抗體，37℃孵育60分鐘。

　　洗滌?：同步驟2。

　　顯色?：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光孵育15-20分鐘。

　　終止?：每孔加入100μL終止液，混勻后30分鐘內(nèi)測(cè)定OD值。

　　結(jié)果計(jì)算?

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　根據(jù)樣本OD值代入曲線計(jì)算濃度，乘以稀釋倍數(shù)得結(jié)果。

　　五、注意事項(xiàng)

　　試劑保存?：未使用試劑盒需2-8℃避光保存，有效期6個(gè)月;復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品可分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

　　樣本處理?：避免使用含的樣本，防止HRP活性。

　　操作規(guī)范?：移液需，避免氣泡;洗滌需，防止交叉污染。

　　安全防護(hù)?：終止液含強(qiáng)酸，需戴手套操作。

　　六、預(yù)期結(jié)果

　　靈敏度?：≤1.54 pg/mL(實(shí)際以說(shuō)明書為準(zhǔn))。

　　檢測(cè)范圍?：典型范圍為3.12-200 pg/mL，部分試劑盒擴(kuò)展至62.5-2000 pg/mL。

　　重復(fù)性?：板內(nèi)/板間變異系數(shù)分別<10%和<15%。

　　七、常見問(wèn)題解答

　　Q?：顯色過(guò)淺或過(guò)深?

　　A?：調(diào)整樣本稀釋倍數(shù)或孵育時(shí)間;確保底物新鮮配制。

　　Q?：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差?

　　A?：檢查復(fù)溶操作，避免氣泡;更換移液器吸頭。

　　注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。

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