人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒實驗使用說明書

　　BS-0121人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒

　　一、試劑盒簡介

　　本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)技術，專用于定量檢測人血清、血漿或細胞培養上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。TNF-α是一種關鍵的細胞因子，在炎癥反應、免疫調節及細胞凋亡中發揮重要作用。本試劑盒僅供科研使用，不可用于臨床診斷。

　　二、試劑盒組成

　　預包被抗體酶標板?：96孔板，包被有抗人TNF-α單克隆抗體，用于捕獲樣本中的TNF-α。

　　凍干標準品?：2支，用于繪制標準曲線，濃度范圍覆蓋檢測需求。

　　生物素標記檢測抗體?：與TNF-α特異性結合，形成免疫復合物。

　　辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)?：與生物素標記抗體結合，催化顯色反應。

　　顯色底物(TMB)?：在HRP催化下產生藍色產物，酸終止后變黃。

　　終止液(2M溶液)?：終止顯色反應，穩定顏色。

　　濃縮洗滌液(20倍)?：用于洗滌酶標板，去除未結合物質。

　　樣本稀釋液?：稀釋樣本至適宜濃度。

　　封板膜?：防止蒸發和污染。

　　注：所有試劑需2-8℃避光保存，有效期6個月。

　　三、實驗前準備

　　試劑平衡?：所有試劑及樣本使用前需室溫(18-25℃)平衡30分鐘，避免直接加熱。

　　標準品配制?：

　　每支凍干標準品加1mL標準品稀釋液，室溫靜置10分鐘，輕柔混勻。

　　配制梯度：從原液(如2000pg/mL)開始，進行系列稀釋(如1000→500→250→125→62.5→31.2→0pg/mL)，共7個濃度點，空白孔為0pg/mL。

　　洗滌液配制?：20mL濃縮洗滌液加580mL蒸餾水，混勻備用。

　　檢測抗體工作液?：臨用前將生物素標記抗體用檢測稀釋液按1:100稀釋(如10μL抗體+990μL稀釋液)。

　　酶結合物工作液?：HRP標記鏈霉親和素按1:100稀釋。

　　四、樣本處理

　　血清/血漿?：避免溶血，4℃保存不超過3天，-20℃長期保存避免反復凍融。檢測前離心去除顆粒物。

　　細胞培養上清?：離心去除細胞碎片，檢測前確認細胞狀態。若樣本濃度過高，建議預實驗確定稀釋倍數。

　　五、操作步驟

　　加樣?：每孔加入100μL標準品或樣本，37℃孵育90分鐘。

　　洗滌?：棄去孔內液體，每孔加400μL洗滌液，靜置1-2分鐘后甩干，重復3次。

　　加檢測抗體?：每孔加100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘。

　　洗滌?：同步驟2，重復3次。

　　加酶結合物?：每孔加100μL酶結合物工作液，37℃孵育30分鐘。

　　洗滌?：同步驟2，重復5次。

　　顯色?：每孔加90μL TMB底物，37℃避光孵育15分鐘。

　　終止反應?：每孔加50μL終止液，立即測定OD值(450nm波長)。

　　六、注意事項

　　標準曲線異常處理?：

　　平直曲線：檢查標準品溶解是否充分、洗板是否凈、移液是否準確。

　　高值樣本：建議稀釋后復測。

　　樣本處理?：

　　避免使用含NaN3的樣本，因NaN3抑制HRP活性。

　　細胞上清需離心后檢測，避免細胞碎片干擾。

　　關鍵控制點?：

　　每步孵育時間誤差不超過±5分鐘。

　　洗板時拍板力度適中，避免交叉污染。

　　顯色時間嚴格控制，避免過度反應。

　　七、結果計算

　　以標準品濃度(pg/mL)為橫坐標，OD450值為縱坐標繪制標準曲線。

　　樣本OD值代入標準曲線方程計算濃度，若超出檢測范圍(如31.2-2000pg/mL)需稀釋后重測。

　　靈敏度：最小檢測濃度小于15pg/mL，板內/板間變異系數<10%。

　　八、常見問題解答

　　問題現象 可能原因 解決方案

　　顯色過快 酶結合物過量 減少孵育時間或稀釋酶結合物

　　背景過高 洗滌不凈 增加洗滌次數至5次

　　重復性差 移液誤差 校準移液器，使用多道加樣器

　　九、儲存條件

　　未開封試劑盒：2-8℃避光保存。

　　已配制試劑：標準品溶液建議現配現用，其他工作液4℃保存不超過7天。

　　注：以上僅供參考，本產品僅供科研使用，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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